一、摘要

美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）建議在進(jìn)行阿昔洛韋霜的體外滲透測試（IVPT）時(shí)，在每次取樣間隔進(jìn)行完荃介質(zhì)更換，原因是存在“明顯的負(fù)向通量"。完荃更換需要大量的分析干預(yù)或復(fù)雜的自動(dòng)化操作，并且通常需要使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）來檢測如此低的濃度，所有這些都可能既昂貴又復(fù)雜。選擇使用等分取樣法進(jìn)行IVPT可能更簡單，并允許使用成本較低的液相色譜（LC）設(shè)備，因?yàn)樵谘芯科陂g，分析物的濃度足夠高，可以使用高效液相色譜紫外檢測（HPLC UV detection）進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)在整個(gè)延長的運(yùn)行過程中保持溶解度漏斗條件。這項(xiàng)研究顯示，在使用現(xiàn)代擴(kuò)散裝置進(jìn)行阿昔洛韋霜的IVPT時(shí)，等分取樣是合適的，這可能是由于擴(kuò)散池設(shè)計(jì)的創(chuàng)新確保了接收室和臂干的均一性，消除了“明顯的負(fù)向通量"，這是業(yè)界一直無法解釋的現(xiàn)象。盡管本研究使用的是阿昔洛韋作為測試成分，但部分介質(zhì)更換也可以用于其他化合物，如類固醇或抗真菌化合物。

二、引言

在美國，許多藥品的通用版本廣泛可用，這對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。¹ 通用藥品的經(jīng)濟(jì)可負(fù)擔(dān)性直接源于開發(fā)大多數(shù)通用藥品時(shí)采用的高效科學(xué)和監(jiān)管方法，這通常依賴于比較藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究來評(píng)估藥物在作用部位或附近的釋放速率和程度是否與參考上市藥品（RLD）一致。²

這種方法用于評(píng)估比較生物利用度（BA）是最準(zhǔn)確、最敏感且蕞具可重復(fù)性的方法之一，以證明通用藥品的生物等效性（BE）。對(duì)于旨在輸送到全身循環(huán)的藥物，如許多口服劑型一樣，這種方法涉及在給藥后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血液樣本，并測量血漿或血清中的藥物（或相關(guān)分析物）濃度，這是一個(gè)相對(duì)簡單的過程。然而，對(duì)于局部作用藥物，如局部皮膚用藥產(chǎn)品，評(píng)估藥物在皮膚作用部位或附近的濃度更具挑戰(zhàn)性。因此，通用版局部用藥的開發(fā)通常依賴于比較臨床終點(diǎn)BE研究，這些研究不如PK研究準(zhǔn)確、敏感和可重復(fù)，且成本更高、耗時(shí)更長。大多數(shù)通用局部用藥產(chǎn)品被歸入昂貴且低效的開發(fā)路徑，因此成為通用藥品開發(fā)商進(jìn)入市場的障礙，并對(duì)它們的可獲得性和經(jīng)濟(jì)性產(chǎn)生了負(fù)面影響。

局部皮膚用藥產(chǎn)品中顯著的例外是含有糖皮質(zhì)激素的藥物，美國食品和藥物管理局推薦使用更高效的體內(nèi)藥效學(xué)（PD）血管收縮試驗(yàn)來證明其BE。因此，盡管這些含糖皮質(zhì)激素的乳膏、軟膏和其他局部劑型只占局部皮膚用藥產(chǎn)品的一小部分，但這些RLD產(chǎn)品有多個(gè)通用版本可供選擇。本研究的假設(shè)是，如果可以開發(fā)出同樣高效的皮膚PK、BE方法，這些方法可以促進(jìn)更多經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的通用局部皮膚用藥產(chǎn)品的可用性。

近幾十年來，已經(jīng)考慮了現(xiàn)有體外和體內(nèi)皮膚PK方法的可行性，每種方法都有不同的優(yōu)勢和局限性。在這些方法中，最有前景的是體外滲透試驗(yàn)（IVPT）方法，該方法已顯示出與體內(nèi)結(jié)果的良好相關(guān)性。值得注意的是，IVPT研究特別顯示出與體內(nèi)評(píng)估BE的相關(guān)性，并具有預(yù)測性。

本工作的目標(biāo)是評(píng)估一種用于阿昔洛韋霜BA的IVPT方法，完荃更換接收液³與部分更換接收液相比。

該研究由一位經(jīng)驗(yàn)豐富的教授監(jiān)督，在孟買Chembur East的Vivekanand教育協(xié)會(huì)藥學(xué)院（VES Pharmacy）由一名訓(xùn)練有素的研究員進(jìn)行。Hanson的Phoenix DB-6系統(tǒng)已安裝，并在研究開始前由位于印度孟買的Teledyne Hanson服務(wù)工程師進(jìn)行了IQ、OQ、PQ驗(yàn)證。

三、材料和方法

材料：本研究使用了以下試劑和材料。

以下儀器在本研究中使用：

皮膚：皮膚樣本取自印度馬哈拉施特拉邦Navi Mumbai的國家燒傷中心。

皮膚準(zhǔn)備：皮膚采集程序：

第一階段：使用取皮刀獲取皮膚，并儲(chǔ)存在含有抗生素的50%甘油中。

第二階段：將每條皮膚從50%甘油轉(zhuǎn)移到含有抗生素的85%甘油中。

第三階段：第二階段后（21天），皮膚在4-8°C下儲(chǔ)存在85%甘油中。

分析當(dāng)天，皮膚被解凍、清洗并用PBS溶液（接收介質(zhì)）沖洗，根據(jù)所需數(shù)量使用模具和沖孔機(jī)（Neiko 0261 14A重型工具01594L，Duty空心孔沖孔套裝）切成25毫米的圓形片段；每片皮膚都在放大鏡下進(jìn)行視覺檢查，以確認(rèn)是否有任何損傷或不適合使用的情況，作為完整性確認(rèn)的一部分。此外，使用校準(zhǔn)的微螺旋測微器測量每個(gè)皮膚部分的厚度。厚度測量完成后，將皮膚安裝在12毫升Franz擴(kuò)散池的供體隔室中。

體外滲透試驗(yàn)

使用Teledyne Hanson擴(kuò)散系統(tǒng)（手動(dòng)系統(tǒng)，Phoenix DB-6）進(jìn)行IVPT實(shí)驗(yàn)。使用了12毫升的擴(kuò)散池，其滲透面積為1.0平方厘米。接收液是含有0.1%疊氮鈉的PBS緩沖液（pH 7.4），攪拌速度為400轉(zhuǎn)/分鐘。皮膚樣本安裝在擴(kuò)散池中，表皮面向供體隔室（n = 3）。使用正位移移液器將單劑量26.55毫克/平方厘米的阿昔洛韋霜（每平方厘米1.37毫克阿昔洛韋）涂在皮膚表面。在皮膚表面涂抹霜?jiǎng)┖螅谜灰埔埔浩鞯谋┞毒鬯姆蚁┘饬⒙Z輕輕將制劑涂抹在整個(gè)滲透區(qū)域。劑量應(yīng)用區(qū)域在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持開放，不進(jìn)行任何封閉。IVPT實(shí)驗(yàn)持續(xù)72小時(shí)，連續(xù)采樣時(shí)間點(diǎn)。選擇兩個(gè)參數(shù)，Jmax和與阿昔洛韋滲透曲線的AUC相對(duì)應(yīng)的累計(jì)總滲透量作為兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。所得的接收液樣品通過高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析。

四、HPLC樣品分析

IVPT樣品在由Jasco 4000系列組成的HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析，配備PDA檢測器和ChromNav數(shù)據(jù)采集軟件，版本1。使用部分驗(yàn)證的HPLC方法對(duì)IVPT樣品進(jìn)行定量測定。采用BakerBond 5μC18（250 x 4.6 mm）柱來洗脫阿昔洛韋。流動(dòng)相為甲醇與50 mM磷酸鈉溶液按5:95（體積比）混合，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0。流速為1.0 mL/分鐘。阿昔洛韋峰在254 nm處檢測。IVPT樣品的進(jìn)樣量為100 µL。IVPT擴(kuò)散樣品的定量下限（LLOQ）為0.025 μg/mL。

五、體外滲透試驗(yàn)（IVPT）結(jié)果

當(dāng)使用從兩名供體獲得的皮膚進(jìn)行IVPT測試實(shí)驗(yàn)，篩選和比較阿昔洛韋霜時(shí)，通過Zovirax霜中阿昔洛韋的皮膚滲透量采用兩種不同的取樣技術(shù)進(jìn)行測量：（i）部分樣品取出和（ii）完荃樣品取出。

圖1和圖2展示了每個(gè)時(shí)間間隔使用部分取樣的IVPT數(shù)據(jù)。觀察到供體內(nèi)部變異性，但供體內(nèi)變異性僅為完荃替換對(duì)照的三分之一（%RSD < 5.0）。兩個(gè)供體的總體結(jié)果表明，阿昔洛韋霜的AUC（0-72小時(shí)）分別為102 µg/cm2和64.4 µg/cm2。阿昔洛韋霜的Jmax分別為2.8 µg/cm2/h和3.9 µg/cm2/h。Tmax為兩個(gè)供體均為24小時(shí)。在完荃替換中可能會(huì)存在高變異性，因?yàn)槊看稳狱c(diǎn)的藥物濃度非常低，這導(dǎo)致許多分析接近定量下限（LLOD）。然而，部分替換穩(wěn)定允許接收液中的活性藥物濃度增加，使用HPLC系統(tǒng)作為分析技術(shù)提供了更好的結(jié)果，因?yàn)榉治鰞x器在檢測范圍內(nèi)運(yùn)行，使得結(jié)果更加一致。

圖1：阿昔洛韋的累積滲透（部分替換）

圖2：阿昔洛韋的滲透曲線（部分替換）

圖3和圖4展示了每個(gè)時(shí)間間隔使用完荃介質(zhì)替換取樣的IVPT數(shù)據(jù)。觀察到供體內(nèi)變異性，但供體內(nèi)變異性非常低（% RSD < 15.0）。兩個(gè)供體的總體結(jié)果表明，阿昔洛韋霜的AUC（0-72小時(shí)）分別為10.9 µg/cm2和4.8 µg/cm2。阿昔洛韋霜的Jmax分別為0.4 µg/cm2/h和0.12 µg/cm2/h。Tmax為兩個(gè)供體均為72小時(shí)。

圖3：阿昔洛韋的累積滲透（完荃替換）

圖4：阿昔洛韋的滲透曲線（完荃替換）

結(jié)果 - 總結(jié)表1

六、結(jié)論

這些結(jié)果表明，IVPT研究可以使用兩種取樣程序進(jìn)行。從數(shù)據(jù)中可以看出，使用部分體積替換產(chǎn)生的變異性小于完荃替換。完荃替換方法觀察到的滯后時(shí)間長達(dá)24小時(shí)，而部分替換研究的滯后時(shí)間僅為4小時(shí)。這24小時(shí)的滯后時(shí)間是由于完荃替換導(dǎo)致的，因此阿昔洛韋的濃度低于HPLC分析的定量下限（LLOQ）。在部分替換研究中，觀察到的Jmax值較高，因?yàn)樵谡麄€(gè)研究期間活性成分的濃度逐漸增加，而在完荃替換的情況下，觀察到的Jmax值非常低。因此，建議在使用完荃替換取樣程序時(shí)使用LC-MS進(jìn)行定量測定。LC-MS是一種昂貴且需要特殊環(huán)境條件進(jìn)行日常維護(hù)的儀器，任何組織都難以承擔(dān)其使用和維護(hù)成本。因此，我們建議在進(jìn)行IVPT研究時(shí)，使用部分替換方法，即在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)不進(jìn)行接收介質(zhì)的完荃替換，而是采用等分試樣取樣程序，特別是當(dāng)使用HPLC分析時(shí)。

七、引用

1. In Vitro Skin Permeation Methodology for over-the counter Topical Dermatologic Products

2. Evaluating Bioequivalence with an In Vitro Permeation Test and an Adaptation of Scaled Average Bioequivalence

3. Draft Guidance on Acyclovir, Recommended Dec 2014,Revised Dec 2016